成都工藝特異型宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)免疫策略

大腸埃希氏菌(Escherichia coli，E. coli)又稱大腸桿菌，其作為模式微生物被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究中。隨著基因治療產(chǎn)業(yè)的大力發(fā)展，大腸桿菌也被主要應(yīng)用于質(zhì)粒DNA（pDNA）的生產(chǎn)。由于質(zhì)粒樣品的常見提取工藝中往往使用條件劇烈的堿溶液進(jìn)行細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)變性，使得其中的HCPs與傳統(tǒng)物理破碎法獲得的HCPs有較大的差異，導(dǎo)致其在采用免疫學(xué)原理的檢測(cè)方法時(shí)，殘留檢測(cè)結(jié)果差別較大。湖州申科生物E.coli克隆菌堿裂HCP殘留檢測(cè)試劑盒用于大腸桿菌（又名大腸埃希菌）克隆菌株相關(guān)的HCPs檢測(cè)，如DH5α、Top10、JM109等。在抗體制備時(shí)采用堿裂工藝制備的HCPs免疫動(dòng)物，獲得專門的抗體。適用于經(jīng)堿液裂解工藝處理后的宿主細(xì)胞蛋白HCPs定量檢測(cè)。

影響宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)結(jié)果的因素之一是樣品質(zhì)量。HCP檢測(cè)貫穿生物制品生產(chǎn)的全過程，涉及收獲、純化、制備等多個(gè)步驟。在不同樣品基質(zhì)下，HCP檢測(cè)可能存在巨大差異。例如，對(duì)于含有佐劑的疫苗，由于佐劑的干擾，難以在成品中對(duì)HCP項(xiàng)目進(jìn)行檢測(cè)，因此一般在吸附工藝之前的原液階段進(jìn)行檢測(cè)。此外樣品的收集、處理和保存方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果至關(guān)重要。不正確的處理可能導(dǎo)致蛋白降解或變性，從而影響檢測(cè)結(jié)果。例如，若采用歷史批樣品作為內(nèi)部質(zhì)控品，應(yīng)結(jié)合其穩(wěn)定性數(shù)據(jù)合理制定保存條件及保存期限，以保證檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

MDCK（Madin-Darby Canine Kidney，馬丁達(dá)比犬腎上皮細(xì)胞）細(xì)胞系是一種來源于犬腎的長(zhǎng)久性細(xì)胞系，其被普遍用作流感病毒增殖與純化、流感疫苗生產(chǎn)等過程中的細(xì)胞基質(zhì)?；谄湟赘行?、高產(chǎn)高滴度、無適應(yīng)性突變、易馴化等優(yōu)勢(shì)，MDCK細(xì)胞成為公認(rèn)的適合于流感病毒毒株分離和流感疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系。與其他產(chǎn)品雜質(zhì)一樣，MDCK宿主殘留蛋白（HCP）可能對(duì)生物制品的安全性和有效性產(chǎn)生不利影響，因此在生產(chǎn)監(jiān)測(cè)、產(chǎn)品放行等過程中需要對(duì)其進(jìn)行定量研究并進(jìn)行嚴(yán)格控制。SHENTEK^® MDCK HCP殘留檢測(cè)試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法）是湖州申科生物自主研發(fā)的、具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的、實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵試劑全國(guó)產(chǎn)化的MDCK HCP通用檢測(cè)試劑盒。本試劑盒適用于基于MDCK細(xì)胞基質(zhì)的病毒增殖及純化、疫苗生產(chǎn)等過程中MDCK宿主殘留蛋白的定量檢測(cè)。本試劑盒操作步驟少，快速，檢測(cè)專一性強(qiáng)，性能穩(wěn)定可靠。

在宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)的分析方法中， ELISA方法是廣泛應(yīng)用的，并作為QC日常放行檢測(cè)的主要手段。ELISA方法相對(duì)簡(jiǎn)單、精度良好，方便設(shè)定控制范圍和建立技術(shù)規(guī)范，適用于產(chǎn)品開發(fā)和過程控制；但ELISA方法檢測(cè)依靠抗原抗體特異性結(jié)合，因此用存在于生物制品中的HCPs作為免疫原生產(chǎn)出的抗體質(zhì)量至關(guān)重要。無論是商品化ELISA試劑盒，還是自制的多克隆抗體，如果抗體的特異性和適用性不夠高，都有可能帶來HCPs漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，從而對(duì)生物制品質(zhì)量安全帶來風(fēng)險(xiǎn)。除此之外，ELISA檢測(cè)HCPs使用多克隆抗體，無法針對(duì)性的提供高風(fēng)險(xiǎn)HCPs殘留蛋白真實(shí)存在情況。

美國(guó)藥典USP通則<1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry（質(zhì)譜法測(cè)定生物藥中殘留宿主細(xì)胞蛋白）主要介紹了LC-MS技術(shù)在宿主細(xì)胞殘留蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用，從樣品制備、質(zhì)譜測(cè)試條件的建立、數(shù)據(jù)的分析、質(zhì)譜方法驗(yàn)證等多個(gè)方面，詳細(xì)闡述了質(zhì)譜技術(shù)在HCPs中應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)與注意事項(xiàng)。作為一種先進(jìn)的分析技術(shù)平臺(tái)，質(zhì)譜技術(shù)在HCPs分析中的應(yīng)用，以及與ELISA方法和其他分析方法結(jié)合使用，有助于生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品的整個(gè)生命周期中更好地理解和建立HCPs的檢測(cè)方法，保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。

湖州申科生物參考USP通則<1132.1>闡述的內(nèi)容，依托公司深耕生物制品質(zhì)量控制領(lǐng)域十余年經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)LC-MS檢測(cè)HCPs方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)與優(yōu)化。同時(shí)通過對(duì)LC-MS檢測(cè)HCPs整體流程建立完整的質(zhì)控，建立起一套抗干擾能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高、結(jié)果真實(shí)可靠的LC-MS檢測(cè)HCPs標(biāo)準(zhǔn)方法。檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)分成樣品制備、質(zhì)譜檢測(cè)、數(shù)據(jù)生信分析及質(zhì)譜結(jié)果方法驗(yàn)證四部分，已使用LC-MS平臺(tái)進(jìn)行了293T、不同工藝E.coli、CHO、Vero、MDCK、Sf9等不同工程細(xì)胞HCPs抗體覆蓋率的檢測(cè)分析。