廣東MDCK宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)

美國(guó)藥典USP通則<1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry（質(zhì)譜法測(cè)定生物藥中殘留宿主細(xì)胞蛋白）主要介紹了LC-MS技術(shù)在宿主細(xì)胞殘留蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用，從樣品制備、質(zhì)譜測(cè)試條件的建立、數(shù)據(jù)的分析、質(zhì)譜方法驗(yàn)證等多個(gè)方面，詳細(xì)闡述了質(zhì)譜技術(shù)在HCPs中應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)與注意事項(xiàng)。作為一種先進(jìn)的分析技術(shù)平臺(tái)，質(zhì)譜技術(shù)在HCPs分析中的應(yīng)用，以及與ELISA方法和其他分析方法結(jié)合使用，有助于生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品的整個(gè)生命周期中更好地理解和建立HCPs的檢測(cè)方法，保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。

為什么定制化試劑盒是宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)的優(yōu)先選擇？原因之一是來(lái)源特定工藝下抗原及校準(zhǔn)品更具代表性。不同生物制品的上游生產(chǎn)工藝，包括培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件，收獲時(shí)機(jī)等差異，均會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的HCPs的蛋白種類、豐度以及蛋白翻譯修飾不同，因此進(jìn)入到下游純化工藝的HCP類型也隨之發(fā)生變化，尤其是與藥物主成分共純化的HCPs會(huì)成為優(yōu)勢(shì)蛋白而存在于藥物原液或制劑中。HCP定制化ELISA檢測(cè)試劑盒通常選取實(shí)際生產(chǎn)工藝中上游發(fā)酵后的樣品進(jìn)行抗原及校準(zhǔn)品的制備，所制備的校準(zhǔn)品可以較為充分地反映實(shí)際生產(chǎn)工藝中的HCP，減少因抗原校準(zhǔn)品種類不足導(dǎo)致的漏檢以及定量不準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)。

宿主細(xì)胞殘留蛋白（HCP）檢測(cè)是生物制品質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采用基于抗體的免疫學(xué)方法（如ELISA）。然而，不同試劑盒之間的檢測(cè)結(jié)果常存在明顯差異，關(guān)鍵原因在于其依賴的關(guān)鍵組分——HCP校準(zhǔn)品和檢測(cè)抗體——本身制備與表征的高度可變性。校準(zhǔn)品作為定量的基準(zhǔn)，其復(fù)雜性極大。不同供應(yīng)商在制備時(shí)使用的細(xì)胞來(lái)源、培養(yǎng)及表達(dá)條件、宿主蛋白提取純化工藝（例如目標(biāo)產(chǎn)物去除策略）差異明顯，導(dǎo)致校準(zhǔn)品的組成、代表性及穩(wěn)定性各不相同。同樣，檢測(cè)抗體（尤其是多抗）通過(guò)免疫動(dòng)物獲得，其特異性與覆蓋度受免疫原、動(dòng)物應(yīng)答個(gè)體差異、免疫方案及后續(xù)抗體篩選/純化過(guò)程的影響巨大，不同批次或來(lái)源抗體的識(shí)別譜（如對(duì)不同HCP的親和力、對(duì)低豐度蛋白的靈敏度）存在本質(zhì)差別。正是這些關(guān)鍵組分固有的明顯變異度，導(dǎo)致不同試劑盒對(duì)同一樣本的檢測(cè)結(jié)果在數(shù)值上、甚至特定HCP的檢出能力上可能出現(xiàn)較大偏差。因此，為確保檢測(cè)結(jié)果真實(shí)反映自身產(chǎn)品的HCP殘留情況，企業(yè)應(yīng)結(jié)合自身產(chǎn)品特性和工藝，對(duì)不同試劑盒進(jìn)行詳細(xì)的平行比對(duì)與適用性評(píng)估，以篩選出匹配度較高的檢測(cè)方案。

影響宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)結(jié)果的因素之一是方法選擇。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法（LC-MS法）是目前HCP檢測(cè)的兩大常用方法。文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)顯示，目前對(duì)于總HCP定量，ELISA仍是主流方法；MS法作為對(duì)特定蛋白（例如，高風(fēng)險(xiǎn)蛋白）的鑒定和定量，已成為重要的互補(bǔ)手段。此外檢測(cè)過(guò)程中使用的試劑和耗材的質(zhì)量直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。低質(zhì)量的試劑可能導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。例如，抗體的特異性和親和力不足，可能導(dǎo)致ELISA檢測(cè)中的交叉反應(yīng)；抗原代表性不強(qiáng)或是抗體覆蓋率低，可能會(huì)導(dǎo)致漏檢；稀釋液抗干擾能力弱，可能影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。案例研究表明，采用定制化方法替代原有商業(yè)化試劑盒后，抗原代表性和抗體覆蓋率明顯提高，HCP檢測(cè)值整體升高。

在宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)的分析方法中， ELISA方法是廣泛應(yīng)用的，并作為QC日常放行檢測(cè)的主要手段。ELISA方法相對(duì)簡(jiǎn)單、精度良好，方便設(shè)定控制范圍和建立技術(shù)規(guī)范，適用于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和過(guò)程控制；但ELISA方法檢測(cè)依靠抗原抗體特異性結(jié)合，因此用存在于生物制品中的HCPs作為免疫原生產(chǎn)出的抗體質(zhì)量至關(guān)重要。無(wú)論是商品化ELISA試劑盒，還是自制的多克隆抗體，如果抗體的特異性和適用性不夠高，都有可能帶來(lái)HCPs漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，從而對(duì)生物制品質(zhì)量安全帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。除此之外，ELISA檢測(cè)HCPs使用多克隆抗體，無(wú)法針對(duì)性的提供高風(fēng)險(xiǎn)HCPs殘留蛋白真實(shí)存在情況。

LC-MS技術(shù)作為生物制品宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)新趨勢(shì)，需考慮以下幾點(diǎn)：①穩(wěn)定性：需要HCPs LC-MS檢測(cè)流程進(jìn)行驗(yàn)證，全流程都需要有嚴(yán)格的QC控制，確保檢測(cè)結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性。②可重復(fù)性：不同類型生物制品中HCPs提取效率不同，不同人員操作存在差異，需要在上機(jī)前通過(guò)不同方法評(píng)估HCPs的提取效率，避免人為因素造成結(jié)果重復(fù)性差。③準(zhǔn)確度：方法開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證階段，通過(guò)設(shè)立內(nèi)標(biāo)與定量算法，根據(jù)內(nèi)標(biāo)響應(yīng)回算得到HCPs的含量，確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。④抗干擾能力：高豐度蛋白和特殊基質(zhì)會(huì)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)產(chǎn)生影響，需要通過(guò)前處理手段對(duì)高豐度蛋白或特殊的基質(zhì)進(jìn)行去除，以減少其對(duì)HCPs肽段在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)的影響。⑤真實(shí)性：樣品中除HCPs以外的物質(zhì)在質(zhì)譜分析中同樣會(huì)產(chǎn)生質(zhì)譜信號(hào)，需要去除復(fù)雜的背景噪音避免假陽(yáng)性和假陰性的出現(xiàn)，建立合理標(biāo)準(zhǔn)的生信分析流程。分析流程建立過(guò)程中同樣需要建立嚴(yán)格的質(zhì)控QC標(biāo)準(zhǔn)，并通過(guò)后期不同方法進(jìn)行驗(yàn)證，確定其標(biāo)準(zhǔn)的真實(shí)性。