生物制品宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測方法對比

湖州申科生物CHO-K1 HCP 殘留檢測試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法）基于固相酶聯(lián)免疫吸附分析法，適用于基于CHO-K1細(xì)胞生產(chǎn)的生物制品中宿主殘留蛋白的定量檢測。該分析方法通過在預(yù)包被抗CHO-K1HCPs綿羊多抗的酶標(biāo)板中加入校準(zhǔn)品或待測樣品、HRP標(biāo)記的抗CHO-K1HCPs綿羊多抗進(jìn)行共孵育。洗滌后，加入TMB底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，再使用終止液終止酶催化反應(yīng)。利用酶標(biāo)儀在450nm波長下測讀吸光度，其吸光度與校準(zhǔn)品或待測樣品中的HCPs濃度成正相關(guān)，通過校準(zhǔn)品擬合的劑量-反應(yīng)曲線即可計(jì)算得出待測樣品中HCPs的濃度。本試劑盒對待測樣品無需進(jìn)行特殊處理，只需通過合適的稀釋比例進(jìn)行適用性驗(yàn)證即可直接使用。本試劑盒操作步驟少，快速，檢測專一性強(qiáng)，性能穩(wěn)定可靠。

湖州申科生物結(jié)合不同宿主實(shí)際的生產(chǎn)工藝，通過高質(zhì)量免疫原和 HCP 多抗的標(biāo)準(zhǔn)化制備流程，獲得高效價、高覆蓋率的抗體，開發(fā)了適用于大腸桿菌表達(dá)菌 (BL21) 生產(chǎn)工藝、克隆菌堿裂法提取質(zhì)粒工藝的 SHENTEK®E.coli HCP檢測試劑盒， 適用于CHO\MDCK\HEK293\Sf9\VERO\畢赤酵母等不同宿主的 HCP 檢測試劑盒。用于中間品、原液及終產(chǎn)品等的HCP定量監(jiān)測。為確保 ELISA 對HCP定量檢測的準(zhǔn)確性，須對 HCP 抗體覆蓋率進(jìn)行驗(yàn)證。湖州申科抗體覆蓋率平臺采用2D Clean-up 試劑盒去除蛋白樣品的干擾物（洗滌劑、鹽、脂質(zhì)、酚類和核酸等離子污染物），并設(shè)置2D 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控，同時以陰性抗體為對照平行試驗(yàn)，以提高結(jié)果準(zhǔn)確度。

美國藥典USP通則<1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry（質(zhì)譜法測定生物藥中殘留宿主細(xì)胞蛋白）主要介紹了LC-MS技術(shù)在宿主細(xì)胞殘留蛋白檢測中的應(yīng)用，從樣品制備、質(zhì)譜測試條件的建立、數(shù)據(jù)的分析、質(zhì)譜方法驗(yàn)證等多個方面，詳細(xì)闡述了質(zhì)譜技術(shù)在HCPs中應(yīng)用的優(yōu)勢與注意事項(xiàng)。作為一種先進(jìn)的分析技術(shù)平臺，質(zhì)譜技術(shù)在HCPs分析中的應(yīng)用，以及與ELISA方法和其他分析方法結(jié)合使用，有助于生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品的整個生命周期中更好地理解和建立HCPs的檢測方法，保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。

影響宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測結(jié)果的因素之一是操作規(guī)范。一方面，實(shí)驗(yàn)人員的專業(yè)技能和經(jīng)驗(yàn)對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性有很大影響。熟練的實(shí)驗(yàn)人員能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行樣品處理、試劑配制和儀器操作，減少人為誤差。另一方面，一個合理的HCP檢測方法，在開發(fā)及應(yīng)用時，應(yīng)當(dāng)考慮操作的合理變動區(qū)間（即耐用性）并設(shè)置相質(zhì)控，從程序上盡量消除人為誤差對結(jié)果的影響。此外，嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)操作流程（SOP）是確保檢測結(jié)果可靠性的關(guān)鍵。操作步驟的不規(guī)范可能導(dǎo)致結(jié)果的重復(fù)性差或誤差增大。目前，湖州申科已正式推出全自動化HCP ELISA檢測系統(tǒng)，可以完成從樣品制備、孵育、洗板至數(shù)據(jù)采集等一系列操作，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（LIMS），可以實(shí)現(xiàn)“輸入即輸出”，減少流程誤差。

磷脂酶B樣蛋白2（Phospholipase B-Like 2，PLBL2/PLBD2），因其強(qiáng)共純化能力、強(qiáng)免疫原性和潛在的酶活性，被認(rèn)為是CHO HCP的關(guān)鍵高風(fēng)險因子之一。目前行業(yè)建議，需要開發(fā)特定的檢測方法對這些已知蛋白或特定蛋白進(jìn)行監(jiān)控以更好地把控其潛在風(fēng)險。SHENTEK^® CHO PLBL-2殘留檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）是湖州申科生物自主研發(fā)的、具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的CHO PLBL-2蛋白通用檢測試劑盒。本試劑盒適用于基于CHO表達(dá)系統(tǒng)的生物制品中CHO HCP高風(fēng)險蛋白PLBL-2的定量檢測。本試劑盒操作步驟少，快速，檢測專一性強(qiáng)，性能穩(wěn)定可靠。

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）ELISA定制化開發(fā)平臺需要具備完善的開發(fā)體系，可靠的技術(shù)平臺，專業(yè)的開發(fā)團(tuán)隊(duì)，以實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定供應(yīng)符合法規(guī)要求的試劑盒。其中校準(zhǔn)品作為關(guān)鍵原材料，其良好的穩(wěn)定性和溯源保障對生命周期至關(guān)重要。為確保校準(zhǔn)品的穩(wěn)定，一般采用凍干工藝制備校準(zhǔn)品，用單因素方差分析方法對校準(zhǔn)品進(jìn)行均一性評估，采用法規(guī)規(guī)定的蛋白定量方法進(jìn)行校準(zhǔn)品的賦值，并溯源至國家標(biāo)準(zhǔn)品（如有）或BSA國家標(biāo)準(zhǔn)品。其次，由于HCPs是復(fù)雜的多分析物，為制備盡可能高覆蓋率的抗體，覆蓋工藝下特有的高風(fēng)險HCPs，需采用可靠的免疫策略。得到符合性能要求的抗體后，需采用經(jīng)過驗(yàn)證的可靠的2D或LC-MS方法進(jìn)行抗體覆蓋率的表征，以確?？贵w可以充分覆蓋各實(shí)際工藝下產(chǎn)生的HCPs。得到了具有代表性的抗原和性能優(yōu)良的抗體后，便是ELISA檢測體系的開發(fā)，主要包括原輔料的篩選和制備研究、各組分工藝及反應(yīng)體系研究、穩(wěn)定性研究等。在檢測體系開發(fā)完成后，需要根據(jù)ICH及藥典要求進(jìn)行分析方法驗(yàn)證的評估，以確保整個檢測體系的線性、范圍、檢測限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度、專屬性以及耐用性等可以滿足法規(guī)要求。