上海Sf9宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測

宿主細(xì)胞蛋白（HCPs）是生物制品生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的關(guān)鍵工藝相關(guān)雜質(zhì)之一，可導(dǎo)致患者不良的免疫反應(yīng)、超敏反應(yīng)，另外也存在導(dǎo)致產(chǎn)品蛋白的降解等問題，影響產(chǎn)品的安全性和有效性，是一項(xiàng)關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)。HCPs殘留檢測應(yīng)用常用的方法是ELISA法，操作簡單、靈敏度高，通量較高，是HCPs殘留檢測的日常放行檢方法，各國藥典規(guī)定了用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行HCPs殘留檢測。然而，ELISA 方法檢測HCP殘留仍面臨諸多挑戰(zhàn)。在實(shí)際的工藝生產(chǎn)過程中，宿主來源、生產(chǎn)工藝、純化方式、生產(chǎn)規(guī)模等因素均可能對HCPs的種類及復(fù)雜性產(chǎn)生影響。

LC-MS技術(shù)作為生物制品宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測新趨勢，需考慮以下幾點(diǎn)：①穩(wěn)定性：需要HCPs LC-MS檢測流程進(jìn)行驗(yàn)證，全流程都需要有嚴(yán)格的QC控制，確保檢測結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性。②可重復(fù)性：不同類型生物制品中HCPs提取效率不同，不同人員操作存在差異，需要在上機(jī)前通過不同方法評估HCPs的提取效率，避免人為因素造成結(jié)果重復(fù)性差。③準(zhǔn)確度：方法開發(fā)與驗(yàn)證階段，通過設(shè)立內(nèi)標(biāo)與定量算法，根據(jù)內(nèi)標(biāo)響應(yīng)回算得到HCPs的含量，確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。④抗干擾能力：高豐度蛋白和特殊基質(zhì)會對質(zhì)譜檢測產(chǎn)生影響，需要通過前處理手段對高豐度蛋白或特殊的基質(zhì)進(jìn)行去除，以減少其對HCPs肽段在質(zhì)譜檢測時(shí)的影響。⑤真實(shí)性：樣品中除HCPs以外的物質(zhì)在質(zhì)譜分析中同樣會產(chǎn)生質(zhì)譜信號，需要去除復(fù)雜的背景噪音避免假陽性和假陰性的出現(xiàn)，建立合理標(biāo)準(zhǔn)的生信分析流程。分析流程建立過程中同樣需要建立嚴(yán)格的質(zhì)控QC標(biāo)準(zhǔn)，并通過后期不同方法進(jìn)行驗(yàn)證，確定其標(biāo)準(zhǔn)的真實(shí)性。

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）ELISA定制化開發(fā)平臺需要具備完善的開發(fā)體系，可靠的技術(shù)平臺，專業(yè)的開發(fā)團(tuán)隊(duì)，以實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定供應(yīng)符合法規(guī)要求的試劑盒。其中校準(zhǔn)品作為關(guān)鍵原材料，其良好的穩(wěn)定性和溯源保障對生命周期至關(guān)重要。為確保校準(zhǔn)品的穩(wěn)定，一般采用凍干工藝制備校準(zhǔn)品，用單因素方差分析方法對校準(zhǔn)品進(jìn)行均一性評估，采用法規(guī)規(guī)定的蛋白定量方法進(jìn)行校準(zhǔn)品的賦值，并溯源至國家標(biāo)準(zhǔn)品（如有）或BSA國家標(biāo)準(zhǔn)品。其次，由于HCPs是復(fù)雜的多分析物，為制備盡可能高覆蓋率的抗體，覆蓋工藝下特有的高風(fēng)險(xiǎn)HCPs，需采用可靠的免疫策略。得到符合性能要求的抗體后，需采用經(jīng)過驗(yàn)證的可靠的2D或LC-MS方法進(jìn)行抗體覆蓋率的表征，以確?？贵w可以充分覆蓋各實(shí)際工藝下產(chǎn)生的HCPs。得到了具有代表性的抗原和性能優(yōu)良的抗體后，便是ELISA檢測體系的開發(fā)，主要包括原輔料的篩選和制備研究、各組分工藝及反應(yīng)體系研究、穩(wěn)定性研究等。在檢測體系開發(fā)完成后，需要根據(jù)ICH及藥典要求進(jìn)行分析方法驗(yàn)證的評估，以確保整個(gè)檢測體系的線性、范圍、檢測限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度、專屬性以及耐用性等可以滿足法規(guī)要求。

各國法規(guī)要求必須對生物藥品進(jìn)行分析和純化，以將宿主細(xì)胞蛋白HCP降低到可接受的水平；即使終產(chǎn)品中痕量的宿主細(xì)胞蛋白HCP到達(dá)患者體內(nèi)，尚不清楚特定的殘留蛋白質(zhì)雜質(zhì)是否會影響藥物的穩(wěn)定性或免疫原性。關(guān)于HCP的限量標(biāo)準(zhǔn)，美國藥典推薦值為終產(chǎn)品的HCP水平1-100 ng/mg；中國藥典各論中E.coli菌體HCP應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.10% (1000 ng/mg)，CHO細(xì)胞HCP應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.05% (500 ng/mg)，假單胞菌HCP應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.02% (200 ng/mg)。

對于HCP抗體的純化方法，目前美國藥典1132章節(jié)推薦有兩種方式，包括protein A或protein G親和柱層析法和HCP抗原親和柱層析法。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，均符合監(jiān)管的要求。在實(shí)際使用過程中，這對不同產(chǎn)品可能會導(dǎo)致檢測結(jié)果的差異。兩者方法得到的抗體主要區(qū)別是HCP抗體有效含量的占比。HCP抗原親和柱層析法顯然占比高，但是也存在某些HCP抗體丟失的情況，這也會導(dǎo)致針對某些樣本的檢測結(jié)果比前者偏低，需要企業(yè)在實(shí)際方法建立時(shí)進(jìn)行充分的評估。HCP抗原親和柱層析法對純化工藝要求更高，為保證抗體批間一致性，需要重點(diǎn)考察HCP抗原柱制備工藝、柱子的使用壽命、再制備的一致性等問題。

大腸埃希氏菌(Escherichia coli，E. coli)又稱大腸桿菌，其作為模式微生物被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究中。隨著基因治療產(chǎn)業(yè)的大力發(fā)展，大腸桿菌也被主要應(yīng)用于質(zhì)粒DNA（pDNA）的生產(chǎn)。由于質(zhì)粒樣品的常見提取工藝中往往使用條件劇烈的堿溶液進(jìn)行細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)變性，使得其中的HCPs與傳統(tǒng)物理破碎法獲得的HCPs有較大的差異，導(dǎo)致其在采用免疫學(xué)原理的檢測方法時(shí)，殘留檢測結(jié)果差別較大。湖州申科生物E.coli克隆菌堿裂HCP殘留檢測試劑盒用于大腸桿菌（又名大腸埃希菌）克隆菌株相關(guān)的HCPs檢測，如DH5α、Top10、JM109等。在抗體制備時(shí)采用堿裂工藝制備的HCPs免疫動物，獲得專門的抗體。適用于經(jīng)堿液裂解工藝處理后的宿主細(xì)胞蛋白HCPs定量檢測。